АКТИВАЦИЯ дельта1-ОПИОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ПРЕДУПРЕЖДАЕТ ПОЯВЛЕНИЕ АРИТМИЙ И НЕОБРАТИМЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ КАРДИОМИОЦИТОВ ПРИ ИШЕМИИ И РЕПЕРФУЗИИ СЕРДЦА: РОЛЬ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ

Ключевые слова ишемия, реперфузия, реперфузионные аритмии, кардиомиоцит, саркоплазматический ретикулум, изолированное сердце, дельта 1-опиоидные рецепторы

Key words ischemia, reperfusion, reperfusion arrhythmias, cardiomyocyte, sarcoplasmic reticulum, isolated heart, delta1-opiate receptors

Аннотация С целью изучения роли кардиальных d1-опиатных рецепторов и внутриклеточного кальция в генезе реперфузионных аритмий и патогенезе возникновения необратимых повреждений кардиомиоцитов в условиях ишемии-реперфузии изолированного перфузируемого сердца проведены серии экспериментов на изолированных сердцах крыс линии Вистар с моделированием длительной тотальной ишемии и последующей реперфузии.

Annotation To study the role of cardiac d1-opiate receptors and intracellular calcium in the origin of reperfusion arrhythmias and the pathogeny of irreversible cardiomyocyte damage under conditions of ischemia/reperfusion of isolated perfused heart, the series of experiments on isolated hearts of Wistar rats with modeling of long-term total ischemia and subsequent reperfusion were made.

Автор Ласукова, Т. В., Маслов, Л. Н., Лишманов, Ю. Б., П.Олтджен, Платонов, А. А., Подоксенов, А. Ю.

Номера и рубрики ВА-N33 от 05/02/2004, стр. 52-56 /.. Экспериментальные исследования

Версия для печати PDFs

Ранее нами были получены убедительные данные, свидетельствующие о выраженном антиаритмическом и кардиопротекторном действии лигандов m-опиоидных рецепторов [1, 3]. Однако в миокарде, как известно, находятся, в основном, d-опиоидные рецепторы [17], которые, в свою очередь, подразделяются на две субпопуляции: d1 и d2 [7]. О роли каждого из названных субтипов d-опиоидных рецепторов (ОР) в регуляции деятельности сердца на сегодняшний день известно сравнительно немного. Так, имеются сведения об антиаритмическом и кардиопротекторном эффекте, сопровождающем стимуляцию d1-рецепторов в условиях коронароокклюзии и реперфузии in vivo [4, 9]. Однако остается неясным, связано ли антиаритмическое и кардиопротекторное действие d1-агонистов с активацией миокардиальных ОР, или же защитное действие этих соединений является результатом стимуляции рецепторов, расположенных экстракардиально? В связи с этим, в настоящем исследовании мы попытались ответить на вопрос, как повлияет активация кардиальных d1-ОР на устойчивость изолированного сердца к ишемическим и реперфузионным повреждениям.

Кроме того, до сих пор неизвестно, через какие внутриклеточные механизмы осуществляются антиаритмические и кардиопротекторные эффекты опиоидов. Существуют данные о способности пептидных агонистов d-ОР модулировать транспорт Са2+ в изолированных кардиомиоцитах на уровне саркоплазматического ретикулума (СПР) [18]. На основании этого мы предположили, что антиаритмические и кардиопротекторные эффекты d1-агонистов также могут быть связаны с участием последних в регуляции транспорта ионов кальция на уровне СПР.

Цель работы: изучение роли кардиальных d1-опиатных рецепторов и внутриклеточного кальция в аритмогенезе и патогенезе возникновения необратимых повреждений кардиомиоцитов в условиях ишемии-реперфузии изолированного перфузируемого сердца.

Для исследования кардиопротекторного и антиаритмического эффектов активации кардиальных d1-рецепторов нами были проведены серии экспериментов на изолированных сердцах крыс с моделированием длительной (45 мин) тотальной ишемии и последующей 30-минутной реперфузии. В экспериментах использованы крысы-самцы линии Вистар массой 250-300 г. Под легким эфирным наркозом животных выводили из эксперимента с помощью дислокации позвоночника в шейном отделе. Немедленно после этого сердце извлекали и помещали в охлажденный до +4o C раствор Кребса-Хензелайта. После прекращения спонтанных сокращений сердце, освобожденное от фрагментов сосудов, лимфатических узлов и тимуса, помещали в аппарат Лангендорфа и проводили ретроградную перфузию под давлением 52 мм рт.ст. стандартным раствором Кребса-Хензелайта, насыщенным карбогеном (+37оС, рН=7,4) и содержащим (в мМ): NaCl - 120; KCl - 4,8; CaCl2 - 2,0; MgSO4 - 1,2; KH2PO4 - 1,2; NaHCO3 - 20,0; глюкоза - 10,0.

В течение 20 мин сердце адаптировали к условиям нормоксической перфузии. Затем моделировали тотальную ишемию миокарда путём полного прекращения подачи перфузионного раствора на 45 мин и возобновляли перфузию, продолжая наблюдение на протяжении 30 мин. Регистрацию ЭКГ осуществляли с помощью электродов, расположенных на правом предсердии и левом желудочке. Запись ЭКГ производили в течение первых 10 мин реперфузии. При анализе ЭКГ учитывали появление единичных и множественных (более 16 за 10 мин) желудочковых экстрасистол (ЖЭ), желудочковой тахикардии (ЖТ) и фибрилляции (ЖФ).

Степень повреждения кардиомиоцитов оценивали по уровню креатинфосфокиназы (КФК) в оттекающем от сердца перфузате. Активность КФК определяли с помощью энзиматического набора «NAC-activated CK47-20 kit» (Sigma, St.Louis, США) и пересчитывали на 1 гр. ткани сердца за 30 мин. реперфузии.

Активацию кардиальных d1-рецепторов проводили путем добавления DPDPE (H-Tyr-D-Pen-Gly-Phe-D-Pen-OH) [7], синтезированного в компании Multiple Peptide Systems (San Diego, CA, США) в перфузионный раствор в концентрации 0,1 мг/л (154 нМ). Для этого по окончании 30-минутной адаптации к условиям нормоксической перфузии в раствор Кребса-Хензелайта добавляли DPDPE в указанной концентрации, через 10 мин сердце «отмывали» от лиганда в течение ещё 5 мин, после чего моделировали тотальную ишемию (45 мин) и реперфузию (30 мин). В качестве блокатора опиоидных рецепторов использовали налтриндол (компания «Tocris», Бристоль, Великобритания) в концентрации 1 нМ. После 20-минутного стабилизационного периода этим антагонистом перфузировали изолированные сердца крыс в течение 10 мин, затем – 10 мин раствором, содержащим DPDPE, после чего перед моделированием ишемии следовала 5-минутная перфузия сердца буферным раствором без лигандов ОР.

При выборе доз налтриндола и DPDPE мы исходили из ранее опубликованных данных о кардиоваскулярных эффектах этих препаратов [2, 3]. Отдельные серии экспериментов были проведены с ингибитором Са2+-АТФ-азы СПР циклопиазоновой кислотой (10-7 М), которую добавляли в раствор Кребса-Хензелайта (после 20-минутного стабилизационного периода) и перфузировали сердца в течение 10 мин, затем следовала 10-минутная перфузия миокарда раствором, содержащим DPDPE, и 5-минутная «отмывка» сердечной мышцы от препаратов перед тотальной ишемией [8]. Циклопиазоновую кислоту сначала растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO), затем добавляли в перфузионный раствор до конечной концентрации 10-7 М, причем концентрация DMSO в растворе составляла не более 0,01% [8]. В указанной концентрации DMSO, согласно литературным данным [8] и результатам наших пилотных исследований, не влияет на сократимость миокарда и его устойчивость к ишемическим повреждениям. Растворы используемых лигандов ОР (налтриндол, DPDPE) готовили непосредственно перед экспериментом, разводя их в физиологическом растворе. Контролем служили изолированные сердца интактных животных, которые подвергали 45-минутной ишемии и последующей реперфузии.

Результаты экспериментов обработаны статистически с применением t-критерия Стъюдента и критерия c2.

В контрольной группе реперфузия после 45-минутной тотальной ишемии изолированного сердца сопровождалась выраженными нарушениями ритма, повреждением мембран кардиомиоцитов (рис. 1, табл. 1).

Рис. 1. Активность креатинфосфокиназы в перфузионном растворе, собранном за период 30-минутной реперфузии после предварительной активации d1-опиатных рецепторов, на фоне блокады налтриндолом и после обработки циклопиазоновой кислотой (СРА). Где, 1 - исходно, 2 - контроль, 3 - DPDPE 0,5 мг/л, 4 - DPDPE 0,1 мг/л, 5 - налтриндол, 6 - налтриндол + DPDPE, 7 - CPA, 8 - СЗФ + DPDPE, * - Р<0,05- по сравнению с контролем, # - Р<0,05, ## - Р<0,01 по отношению к исходным значениям

где, * - p<0,05 (c2-критерий) по сравнению с контролем

Как видно из данных табл. 1, наличие аритмий в первые 10 мин после восстановления коронарной перфузии регистрировались у 75% препаратов изолированных сердец. В 25% случаев наблюдалась ЖЭ, а 56% и 31% приходились, соответственно, на ЖТ и ЖФ. У всех препаратов сердец ЖТ и ЖФ носили обратимый характер и заканчивались или восстановлением нормального синусового ритма, или переходом в ЖЭ.

Кроме того, после возобновления коронарной перфузии наблюдалось «вымывание» в перфузионный раствор креатинкиназы, что свидетельствует о необратимых ишемических и реперфузионных повреждениях сарколеммы кардиомиоцитов [10, 12]. В наших экспериментах регистрировалось 5-кратное повышение активности указанного фермента в оттекающем от сердца растворе по отношению к исходному уровню КФК в перфузате, собранном до ишемии (рис. 1).

Стимуляция кардиальных d1-ОР посредством 10-минутной перфузии изолированных сердечно-мышечных препаратов раствором, содержащим DPDPE в концентрации 154 нМ, существенно повысила устойчивость изолированного миокарда к аритмогенному действию ишемии-реперфузии. Как видно из данных табл. 1, предварительная перфузия препаратов изолированного сердца раствором, содержащим этот агонист d1-ОР, способствовала снижению вероятности возникновения реперфузионных нарушений ритма. После применения этого препарата нарушения ритма в виде ЖТ отмечались в 2 раза реже, а эпизодов ЖФ вовсе не отмечалось (табл. 1). В экспериментах, проведенных нами ранее [4], также было обнаружено антиаритмическое действие DPDPE при системном введении на модели коронароокклюзии и реперфузии. Данные настоящего исследования позволяют предполагать, что антиаритмический эффект DPDPE как in vivo, так и in vitro связан с активацией рецепторов, расположенных в миокарде.

В этой же серии экспериментов обнаружилось уменьшение реперфузионного выброса КФК из кардиомиоцитов на 40% по сравнению соответствующими величинами контрольного диапазона (рис. 1). Надо сказать, что ранее в экспериментах, выполненных на изолированном сердце, кардиопротекторный эффект был отмечен у неселективного d-агониста DADLE при моделировании локальной ишемии и реперфузии [5]. Исследования J.E.Schultz и соавт. показали, что активация d1-ОР с помощью агониста этих рецепторов TAN-67 также оказывает кардиопротекторное действие, проявляющееся в снижении размеров зоны некроза миокарда при 30-минутной коронароокклюзии и последующей реперфузии in vivo [16]. Следовательно, на основании литературных данных и результатов наших экспериментов можно констатировать, что с помощью агонистов d1-ОР можно эффективно защитить миокард от необратимых повреждений, вызванных ишемией-реперфузией.

Для того, чтобы ответить на вопрос о рецепторной специфичности полученных нами антиаритмического и кардиопротекторного эффектов DPDPE, мы провели эксперименты с использованием налтриндола. Предварительная блокада кардиальных d1-ОР не повлияла на характер реперфузионных аритмий (табл. 1) и степень повреждения сердца (данные не представлены на рисунке). В то же время, налтриндол полностью устранял антиаритмический и кардиопротекторный эффекты DPDPE (табл. 1, рис. 1). Так, после 10-минутной перфузии сердца раствором, содержащим налтриндол, последующая активация d1-рецепторов не вызвала. Из табл. 1 видно, что ингибирование этих рецепторов устраняет антиаритмический эффект DPDPE (табл. 1). Кроме того, применение данного пептида после обработки сердец налтриндолом не оказало кардиопротекторного действия, поскольку повышение активности креатинкиназы в перфузате, вызванное ишемией-реперфузией, оставалось таким же высоким, как и в контроле (рис. 1).

Следовательно, можно утверждать, что обнаруженные нами эффекты обусловлены активацией d1-рецепторов, поскольку, во-первых, DPDPE является селективным агонистом этих рецепторов, во-вторых, на фоне блокады d-ОР налтриндолом кардиопротекторные и антиаритмические эффекты DPDPE обнаружить не удается.

Согласно литературным данным, возникновение реперфузионных аритмий, деструкция мембран кардиомиоцитов во многом обусловлены избыточным поступлением Са2+ в миоплазму из внеклеточного пространства по Са2+-каналам L-типа, за счет Na+/Ca2+-обмена, а также из внутриклеточного депо - СПР [11, 15]. С другой стороны, существуют данные о том, что активация d-рецепторов изолированных кардиомиоцитов увеличивает мобилизацию кальция из СПР [18]. Казалось бы, избыток Са2+ должен способствовать усилению повреждающего действия ишемии-реперфузии. Мы же, напротив, отмечали выраженный защитный эффект, сопровождающий стимуляцию d1-рецепторов.

Одно из возможных объяснений такого, на первый взгляд, противоречия может заключаться в следующем. Исследованиями последних лет доказано, что после кратковременного увеличения концентрации кальция в миоплазме перед моделированием 40-минутной тотальной ишемии значительно увеличивается устойчивость изолированного сердца к повреждениям, вызванным ишемией-реперфузией [13, 14]. Авторы объясняют это тем, что кратковременный подъем [Ca2+]i обеспечивает активацию протеинкиназы С, которая катализирует фосфорилирование ряда белков, регулирующих устойчивость сердца к ишемическим и реперфузионным воздействия [6]. Конечным результатом такой последовательности событий, по мнению M.Ashraf [13, 14] является повышение резистентности миокарда к патогенному действию ишемии и реперфузии.

На основании имеющихся данных литературы о способности d-агонистов увеличивать высвобождение Ca2+ из СПР [18], мы предположили, что обнаруженные нами эффекты DPDPE могут быть обусловлены опиоидергическим изменением транспорта кальция на уровне СПР. Для того, чтобы проверить данную гипотезу, мы продолжили свои исследования, используя ингибитор Са2+-АТФ-азы саркоплазматического ретикулума - циклопиазоновую кислоту [8]. Этот фермент, как известно, обеспечивает энергозависимый транспорт кальция в СПР [8].

Перфузия сердец раствором, содержащим ингибитор Са2+-АТФ-азы циклопиазоновую кислоту в конечной концентрации 10-7 М, не повлияла на частоту и характер реперфузионных аритмий. Кроме того, мы установили, что после применения циклопиазоновой кислоты антиаритмическое действие DPDPE тоже не проявлялось (табл. 1). В условиях ингибирования Са2+-АТФ-азы саркоплазматического ретикулума нам не удалось обнаружить и кардиопротекторный эффект DPDPE (рис. 1).

Таким образом, полученные результаты позволили нам утвердиться в мысли, что повышение устойчивости сердца к повреждениям, вызванным ишемией-реперфузией после предварительной активации d1-рецепторов, может быть связано с изменением транспорта Са2+ на уровне саркоплазматического ретикулума.

Приведенные факты свидетельствуют о том, что стимуляция кардиальных d1-ОР значительно ослабляет аритмогенный эффект ишемии-реперфузии и предупреждает появление необратимых повреждений кардиомиоцитов, возникающих после возобновления коронарной перфузии. Все вышеперечисленные эффекты устраняются селективным блокатором d-рецепторов налтриндолом, что свидетельствует о специфической роли d-ОР в их реализации. Результаты экспериментов с использованием совместного применения ингибитора Са2+-АТФазы СПР и агониста d1-опиоидных рецепторов говорят о том, что повышение устойчивости сердца к аритмогенному действию реперфузии и усиление резистентности кардиомиоцитов к патогенному действию ишемии-реперфузии связаны с опиоидергическим изменением транспорта кальция на уровне саркоплазматического ретикулума.

1. Эндогенные агонисты d-рецепторов не участвуют в аритмогенезе и патогенезе возникновения необратимых повреждений кардиомиоцитов в условиях ишемии-реперфузии изолированного перфузируемого сердца.

2. Предварительная активация кардиальных d1-опиоидных рецепторов предупреждает появление аритмий и необратимых повреждений кардиомиоцитов в условиях ишемии и реперфузии изолированного сердца.

3. Защитные эффекты DPDPE связаны с опиоидергическим изменением транспорта кальция на уровне саркоплазматического ретикулума.

Работа выполнена при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований и гранта Регионального общественного фонда содействия отечественной медицине. Авторы выражают признательность Dr. Kevin J. Gormley (NIDA, США), любезно предоставившему для выполнения исследований DPDPE.

1. Ласукова Т.В., Маслов Л.Н., Лишманов Ю.Б. и др. Влияние стимуляции m-опиоидных рецепторов на сократимость изолированного сердца крыс в условиях нормоксии и ишемии-реперфузии. Физиол. журн. 2001; Т. 87, № 5. С. 649-658.

2. Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н., Крылатов А.В., Ускина Е.В. Роль эндогенных опиоидных пептидов в механизмах антиаритмического эффекта адаптации. Физиол. журн. 1996; Т. 82 № 5-6. С. 48-52.

3. Лишманов Ю.Б., Крылатов А.В., Маслов Л.Н. Роль периферических опиатных рецепторов m- и d-типов в регуляции устойчивости сердца к аритмогенным воздействиям. Физиол. журн. 1997; Т. 83, №7. С. 80-87.

4. Соленкова Н.В., Крылатов А.В., Серебров В.Ю. и др. Роль К-АТФ – каналов в реализации антиаритмического действия агониста d1-опиатных рецепторов DPDPE при коронароокклюзии, реперфузии и постинфарктном кардиосклерозе. Бюлл. Эксперим. биологии и мед. 2001; Приложение 1: С. 23-25.

5. Aitchison K. A., Baxter G. F.,. Awan M. M. Smith R. M., Yellon D. M., Opie L. H. Opposing effects on infarction of delta and kappa opioid receptor activation in the isolated rat heart: implications for ischemic preconditioning. Basic Res. Caldiol. 2000; V. 95. P. 1-10.

6. Clement O., Puceat M., Walsh M. P. Vassort G. Protein kinase C enhances myosin light-chain kinase effects on force development and ATPase activity in rat single skinned cardiac cells. Biochem J. 1992; V. 285. P. 311-317.

7. Dhawan B. N., Cesselin F., Raghubir R. International Union of Pharmacology. XII. Classification of opioid receptors. Pharmacol. Rev.; 1996; V. 48, N 4. P. 567-592.

8. Du Toit E. F., Opie L.H. Antiarrhythmic properties of specific inhibitors of sarcoplasmic reticulum calcium ATPase in the isolated perfused rat heart after coronary artery ligation. Am. Coll. Cardiol. 1994; V. 23, P. 1505-1510.

9. Fryer R. M., Hsu A. K., Nagase H. Gross G. J. Opioid-induced cardioprotection against myocardial infarction and arrhythmias: mitochondrial versus sarcolemmal ATP-sensitive potassium channels. J. Pharmacol. Exp. Ther.; 2000; V. 294, N 2. P. 451-457.

10. Kark M., Tanaka S., Bolling S. F. A. Simon, Tsung-Ping Su, P. R. Oelgen and A. Haverich Myocardial protection by ischemic preconditioning and delta opioid receptor activation in the isolated working rat heart J. of Thoracic and Cardiovascular Surgery; 2001. P. 1-10.

11. Kusuoka H., Marban E. Cellular mechanisms of myocardial stunnung. Am Rev. Physiol. 1992. V. 54. P. 243-256.

12. Limbrino U., Zucchi R., Ronca-Testoni S. Sarcoplasmic reticulum function in the “Stunned” Myocardium. J. Mol. Cell. Cardiol. 1989. V. 21. N 10. P. 1063–1072.

13. Miyawaki H., Zhou X., Ashraf M. Calcium preconditioning elicits strong protection against ischemic injury via protein kinase C signaling pathway. Circ. Res. 1996. V. 79. N 1. P. 137–146.

14. Miyawaki H., Ashraf M. Ca 2+ as a mediator of ischemic preconditioning. Circ. Res. 1997. V. 80. N 6. P. 791– 799.

15. Opie L. H., Coetzee W.A., Dennis S.C., Thrandroyen F. T. A potential role of calcium ions in early ichemic and reperfusion arrhythmias. An N.Y. Acad. Sci. 1988. V. 522. P. 464-477.

16. Schultz J. E. J., Hsu A.K., Nagase H., Gross G. J. TAN-67, a d1-opioid receptor agonist, reduces infarct size via activation of Gi/o proteins and KATP channels. Am. J. Physiol. 1998. V. 274. P. H909-H914.

17. Ventura C., Bastagli L., Bernardi P. Caldarera C.M., Guarnieri C. Opioid receptors in rat cardiac sarkolemma: effect of phenylephrine and isoproterenol. Biochem. Biophys. Acta. 1989. V. 987. P. 69–74.

18. Ventura C., Spurgeon H.A., Lakatta E.G. Guarniernieri C., Capogrossi M.C. k and d opioid receptor stimulation affects cardiac myocyte function and Ca2+ release from an intacellular pool in myocytes and neurons. Circ. Res. 1992. V. 70. P. 66–81.

Наверх

Российский Научно-Практический
рецензируемый журнал
ISSN 1561-8641

Санкт-Петербургское общество кардиологов им Г. Ф. Ланга
НИИК: www.almazovcentre.ru
ИНКАРТ: www.incart.ru